PEG化蛋白質(zhì)的分離純化

　　PEG化蛋白質(zhì)的分離純化你了解多少？經(jīng)PEG修飾后的蛋白質(zhì)是十分復(fù)雜的混合物，這是由于一下這些原因產(chǎn)生的。

　　(1)PEG聚合物分子量分布較寬，如PEG5000的分子量分布在5000±250道爾頓范圍內(nèi)

　　(2)由于被修飾蛋白質(zhì)上待連接的活性位點(diǎn)的活性不同，空間位阻不同，導(dǎo)致每個蛋白分子上連接的PEG數(shù)和PEG連接的位置不同。如超氧化物歧化酶(SOD)有20個可能的PEG連接位點(diǎn)理論上大約有2020種不同的反應(yīng)產(chǎn)物

　　(3)活化的聚乙二醇中還殘留未反應(yīng)的活化劑，未活化的mPEG等，因此經(jīng)PEG修飾后的蛋白質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。一般用色譜方法純化PEG化蛋白質(zhì)。連接PEG后蛋白質(zhì)的分子量有了不同程度的提高，要想將其逐一分開，體積排阻色譜(SEC)就成了較好的方法。但SEC分離同一數(shù)量級的物質(zhì)效果不好，所以對于分子量小且修飾位點(diǎn)少的多肽和小分子蛋白質(zhì)該方法也不是很理想。

　　由于PEG為弱疏水性長鏈，連接PEG后蛋白質(zhì)分子的疏水性有所增強(qiáng)，所以也可以用反相液相色譜(RP-HPLC)分離，但其分離條件的摸索較為煩瑣。再者由于連接了PEG，蛋白質(zhì)分子上的氨基等活性位點(diǎn)減少，其等電點(diǎn)pH都發(fā)生了變化，所以用離子交換色譜(IEC)理論上也可以將其分離。Malik等的研究表明PEG化蛋白質(zhì)的純化難度很大，且純化產(chǎn)量很低，Busby和Ingham認(rèn)為分離難度大的原因在于PEG在水溶液中具有伸展構(gòu)象，其流體動力學(xué)體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同樣分子量的蛋白質(zhì)。

　　例如mPEG6000不能通過截留分子量為12KD的半透膜，在體積排阻色譜中PEG6000的行為類似于分子量25 35KD的球狀蛋白質(zhì)。采用切割分子量為30000Da或50000Da的超濾膜過濾可有效去除mPEG，但該方法不適用于小分子多肽。迄今為止常用的分離方法是先用超濾或透析去除咪唑等小分子活化劑殘余物，然后再用各種色譜法分離。如Snider等用各種色譜法考察PEG-SOD的多態(tài)性。

　　Mcgoff等用體積排阻色譜和離子交換色譜對PEG-SOD進(jìn)行分離及分析。唐微等先利用硫酸銨對反應(yīng)后的混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，有效地去除了溶液中的PEG然后再對離心出的蛋白質(zhì)進(jìn)行體積排阻色譜分離，分離效果較以前好，但該方法同樣也不適于小分子多肽，因?yàn)樾》肿佣嚯牟蝗菀妆畸}析沉淀。另外Zhao等用異丙醇沉淀活化后的聚乙二醇分子可有效去除反應(yīng)時的極性溶劑和副產(chǎn)物，活化聚乙二醇的收率達(dá)90%以上。