一文讀懂 | 色譜柱性能相關(guān)的基本概念與公式

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此承擔(dān)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的核心，也稱為“色譜芯”。那么，影響“色譜芯”的分離效果有哪些因素呢？下面我們將簡要概述色譜柱所涉及的公式和理論，希望能幫助您遇到問題時進行排查。

柱效用于比較不同色譜柱的性能。柱效是描述色譜柱性能引用頻率最高的參數(shù)之一，以理論塔板數(shù) N 表示。

理論塔板數(shù)高的色譜柱柱效更高，色譜圖中的峰寬更窄，分離效果更好。

柱效能反映分離峰的寬窄。柱效高，分離峰窄，才可能有好的分離度。柱效高是高分離度的前提。柱效受柱參數(shù)（內(nèi)徑、柱長、粒度）、洗脫液類型（特別是粘度）、流速或平均線速度的影響。柱效還受化合物及其保留的影響。

常使用每米理論塔板數(shù)（N/m）進行色譜柱的比較，但需要在相同的色譜溫度條件和保留因子（k）下進行。對于較小的固定相，柱效對分離更為重要。

過去稱為容量因子或 k′（k 值），保留因子是指樣品組分停留在固定相中相對其駐留在流動相中的時間之比。用保留時間除以峰不保留時間（t₀）進行計算。

選擇性因子是對兩個色譜峰之間時間或距離的最大測量值。如果 α = 1，則兩個色譜峰具有相同的保留時間并共洗脫。

選擇性因子的定義是容量因子之比。在圖 1 中，您會看到，峰 A 和峰 B 之間的選擇性比峰 B 和峰 C 的選擇性更好。圖中提供了計算說明。

改變流動相或固定相都可以改變選擇性。溫度也是調(diào)節(jié)選擇性的一個因素。

分離度代表色譜柱分離目標峰的能力，因此，分離度越高，兩峰之間越容易得到基線分離。從方程 5 中可以看出，分離度與柱效、選擇性和保留值相關(guān)。可以通過改善這些因素來提高分離度。

在圖 2 中，我們可以看到每個參數(shù)在分離過程中的不同作用。所有這些參數(shù)都呈效應(yīng)遞減趨勢。即取值越大，對分離度的影響就越小。

如果將柱長加倍，將得到更多的理論塔板數(shù)，但分離時間也將延長 2 倍，而分離度只能得到 2 的平方根即 1.4倍的提高。

如果要對色譜峰進行定量，那么分離度最小應(yīng)等于 1。分離度要達到 0.6，才能分辨兩個等高峰間的峰谷。

如需建立耐用方法，理想分離度值一般應(yīng)大于等于 1.7?；€分離并確保最準確定量結(jié)果的分離度應(yīng)為 1.6。

壓力方程（方程 6）包含影響系統(tǒng)壓力的 5 個重要參數(shù)：溶劑粘度 (h)、流速 (F)、柱長 (L)、色譜柱半徑 (r) 和填料粒徑 (dp)。熟悉壓力方程將能很好地理解這些重要參數(shù)對系統(tǒng)壓力的影響。

van Deemter 方程是將柱效作為線速度（u）或流速的函數(shù)對柱效（用 H 表示，見方程 7）進行評價。

H – 稱為塔板高度，或理論塔板高度，用柱長（L）除以理論塔板數(shù)進行計算。我們的目標是得到小塔板高度。

可以通過使用較小填料色譜柱、優(yōu)化線速度，以及使用低粘度流動相，更有效地實現(xiàn)這一目標。隨著粒徑減小，優(yōu)化線速度將增大。

當樣品中存在各種類型的組分時，我們很難用等梯度洗脫（即，恒定流動相組成）在適當時間內(nèi)讓所有組分都得到分離。

梯度洗脫是一個隨時間提高流動相強度的過程，最終使分析速度更快、峰形和定量結(jié)果更好。通過梯度洗脫，峰寬通常將更窄，并保持恒定。

在梯度方程中，S 為常數(shù)，與所分離的分子大小有關(guān)。小分子的 S 值約為 4 到 6，多肽和蛋白質(zhì)的 S 介于 10到 1000 之間。

現(xiàn)在，經(jīng)常使用不同尺寸的色譜柱，或使其更短（例如，為實現(xiàn)更高通量），或使用窄內(nèi)徑柱（如，用于質(zhì)譜檢測）。必須按比例縮短梯度時間（tG）或減小流速（F），以補償柱體積的減少。

使用相同色譜柱時，如果想保持相同的梯度斜率和 k* 值，則需在梯度時間（tG）內(nèi)按比例調(diào)整梯度組成（DF）改變速率或流速（F）。

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